Wykrywanie wirusowego DNA/RNA metodą PCR

W diagnostyce wirusowej, testy amplifikacji kwasów nukleinowych, takie jak łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), pozwalają na wczesne wykrywanie i identyfikację chorób zakaźnych znanych jako retrowirusy. W tej zmodyfikowanej wersji standardowego procesu PCR, mRNA, który służy jako początkowy szablon, jest najpierw odwrotnie transkrybowany do komplementarnego DNA (cDNA), a następnie amplifikowany poprzez PCR do dalszej analizy. W porównaniu z innymi technikami pomiaru mRNA, takimi jak analiza Northern blot, testy ochrony przed RNAse lub hybrydyzacja in situ, RT-PCR jest znacznie bardziej niezawodna w wykrywaniu transkryptu RNA dowolnego genu, niezależnie od jego względnej liczebności. RT-PCR stał się instrumentalnym narzędziem diagnostycznym do wykrywania patogenów, w tym wirusów grypy, enterowirusów, koronawirusów (SARS-CoV-2), wirusa Ebola i HIV.

Retrowirusy

Retrowirus to rodzaj wirusa, którego materiał genetyczny zakodowany jest w RNA. Podobnie jak inne wirusy, retrowirusy przejmują maszynerię komórki w celu replikacji własnych kopii. Po zainfekowaniu komórki retrowirus wykorzystuje swój własny enzym odwrotnej transkryptazy do wytworzenia dwuniciowego DNA z genomu RNA. Nowo zsyntetyzowane wirusowe DNA jest integrowane z genomem komórki gospodarza, a następnie wirus replikuje się jako część DNA komórki gospodarza.

U ludzi wiele retrowirusów wywołuje poważne choroby. Retrowirusy takie jak HIV-1 i HIV-2 wywołują chorobę AIDS, podczas gdy ludzki wirus limfotropowy T powoduje białaczkę (tj. nowotwór krwi) i chorobę demielinizacyjną. Ciężkość tych chorób oraz ciągłe zagrożenie nowymi, pojawiającymi się chorobami zakaźnymi potwierdziły potrzebę opracowania szybkich narzędzi diagnostycznych zdolnych do wykrywania infekcji o niskiej gęstości. Jednym z najbardziej uznanych narzędzi do wczesnego wykrywania infekcji retrowirusowych jest test amplifikacji kwasu nukleinowego.

Testy amplifikacji kwasu nukleinowego

Test amplifikacji kwasu nukleinowego jest przeznaczony do wykrywania małych ilości określonej sekwencji kwasu nukleinowego w celu zidentyfikowania określonego patogenu, często wirusa lub bakterii. Zamiast wykrywania antygenów lub przeciwciał (cel w analizie serologicznej), testy amplifikacji kwasów nukleinowych są ukierunkowane i wykrywają materiały genetyczne, takie jak DNA lub RNA. Wykrywanie materiałów genetycznych pozwala na wczesną diagnozę infekcji przed serokonwersją, czyli okresem, w którym specyficzne przeciwciało rozwija się przeciwko patogenowi i staje się wykrywalne we krwi. Powszechnie stosowane testy amplifikacji kwasów nukleinowych obejmują reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), test przesunięcia nici (SDA) lub test TMA (transcription mediated assay).
PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

Łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

jest wysoce czułą techniką wykrywania i ilościowego określania poziomu ekspresji mRNA. W RT-PCR, szablon RNA jest najpierw odwrotnie przepisywany na komplementarny DNA (cDNA), przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy. Ta zależna od RNA polimeraza DNA, przy udziale starterów odwrotnej transkrypcji, deoksynukleotydów (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP i dCTP), katalizuje syntezę cDNA z odpowiedniej sekwencji docelowego RNA. CDNA jest następnie używany jako szablon do amplifikacji wykładniczej przy użyciu standardowej procedury PCR (denaturacja, annealacja i elongacja). RT-PCR ma wiele zastosowań, w tym analizę ekspresji genów, walidację mikromacierzy, wykrywanie patogenów i badania nad chorobami.

Kwantyfikacja produktów RT-PCR może być ogólnie podzielona na dwie kategorie: punkt końcowy RT-PCR i ilościowe RT-PCR (RT-qPCR).

 

Punkt końcowy RT-PCR

Analiza końcowego punktu RT-PCR, która opiera się na fazie plateau reakcji PCR, jest stosowana do analizy produktów amplifikacji po zakończeniu wszystkich cykli reakcji PCR. W tej metodzie, amplikony są rozdzielane przez elektroforezę na żelu agarozowym i wizualizowane przy użyciu barwnika wiążącego DNA, takiego jak bromek etydyny (EtBr), w celu określenia wielkości cząsteczek DNA w zakresie od 500 do 30,000 bp. Chociaż EtBr jest najczęściej stosowanym barwnikiem do wizualizacji DNA, jest on mutagenny i wysoce toksyczny przy wdychaniu. Zamiast tego należy rozważyć użycie bezpieczniejszych i bardziej przyjaznych dla środowiska, nietoksycznych alternatyw, takich jak Gelite™ X100 (nr kat. 17706), Helixyte™ Green (nr kat. 17590), Helixyte™ Gold (nr kat. 17595), Gelite™ Green (nr kat. 17589) lub Gelite™ Orange (nr kat. 17594).

 

Metody wykrywania punktu końcowego RT-PCR Do kwantyfikacji produktów RT-PCR

 

Porównawcza RT-PCR

Podobne do konkurencyjnego RT-PCR w tym, że docelowe RNA konkuruje o odczynniki amplifikujące w ramach pojedynczej reakcji z wewnętrznym standardem o niepowiązanej sekwencji Wyniki są porównywane z zewnętrzną krzywą standardową w celu określenia docelowego stężenia RNA. Wygodniejsza z trzech metod, ponieważ nie wymaga wcześniejszego oznaczenia mRNA (względna RT-PCR) lub syntezy syntetycznego konkurencyjnego RNA (konkurencyjna RT-PCR)

Konkurencyjna RT-PCR

Technika stosowana do bezwzględnej kwantyfikacji określonej sekwencji mRNA w próbce. Syntetyczne RNA i konkurencyjne RNA są dodawane do replik RNA próbki i są współamplifikowane z endogennym docelowym Wytwarza się krzywą stężenia konkurencyjnego RNA i wykorzystuje się ją do porównania sygnałów RT-PCR wytworzonych z endogennych transkryptów w celu określenia ilości docelowego RNA obecnego w próbce.

Względna RT-PCR

Wykorzystuje primery dla kontroli wewnętrznej multipleksowanej z primerami specyficznymi dla danego genu. Wymaga zgodnej kontroli wewnętrznej i primerów specyficznych dla danego genu. Możliwość porównania względnej liczebności transkryptów w wielu próbkach. Wyniki wyrażane są jako stosunek sygnału genu do sygnału kontroli wewnętrznej, co może być wykorzystane do porównania próbek w szacowaniu względnej ekspresji docelowego RNA.

Zalety, wady i zastosowania końcowego punktu RT-PCR

Punkt końcowy RT-PCR
Zalety	Wygodny – nadaje się do analizy każdej sekwencji dwuniciowego DNA Ekonomiczne – tańsze niż stosowanie sond projektowanych na zamówienie
Wady	Słaba precyzja i niska czułość Krótki zakres dynamiki < 2 logi Niska rozdzielczość, dyskryminacja wyłącznie na podstawie rozmiaru Nie nadaje się do automatyzacji Results are not expressed as numbers Przetwarzanie po PCR
Zastosowania	Analiza ekspresji genów Klonowanie Tworzenie bibliotek cDNA Sekwencjonowanie RNA Rozwój sond mikromacierzowych Identyfikacja gatunków

Barwniki kwasów nukleinowych do elektroforezy w żelu agarozowym i poliakrylamidowym