pH wewnątrzkomórkowe

Wewnątrzkomórkowe pH odgrywa ważną rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak wzrost komórek, regulacja wapnia, aktywność enzymatyczna, transdukcja sygnału za pośrednictwem receptorów, transport jonów, endocytoza, chemotaksja, adhezja komórek i wiele innych. Z pomocą wskaźników fluorescencyjnych wrażliwych na pH badacze są w stanie monitorować wewnątrzkomórkowe wahania pH w żywych komórkach z większą czułością, rozdzielczością przestrzenną i gęstością próbkowania.

Ogólnie rzecz biorąc, wewnątrzkomórkowe pH komórki różni się w zależności od jej różnych przedziałów komórkowych. Na przykład, pH cytozolu wynosi od ∼ 6,8 do 7,4, podczas gdy kwaśne organelle, takie jak lizosomy, mają pH od ∼ 4,5 do 6,0. Dlatego przy wyborze wskaźnika pH ważne jest, aby dopasować jego pKa do pH układu doświadczalnego. Oferujemy różne fluorescencyjne wskaźniki pH, dekstranowe koniugaty wskaźników pH i inne odczynniki do pomiaru pH w układach biologicznych.

Pomiar pH bliskiego neutralnego

BCECF i jego przenikający przez błonę ester AM to najszerzej stosowany fluorescencyjny wskaźnik pH do pomiaru pH wewnątrzkomórkowego. Jego pKa wynosi ∼ 6,98, co jest idealne do pomiaru zmian w cytozolowym pH w różnych typach komórek, jak również do monitorowania zmian pH w środowiskach prawie neutralnych. BCECF ma maksimum absorpcji przy ∼504 nm, punkt izosbitalny przy ∼440 nm i maksimum emisji przy ∼527 nm. Chociaż BCECF wykazuje właściwości ratiometryczne przy podwójnym wzbudzeniu, kilka cech sprawia, że obrazowanie ratiometryczne nie jest optymalne. Duża odległość dzieląca jego punkt izosbitalny od maksimum wzbudzenia, słabe właściwości retencji wewnątrzkomórkowej i słaba absorpcja przy ∼ 440 nm przyczyniają się do niskiego stosunku sygnału do szumu. Co więcej, BCECF jest dostarczany jako złożona mieszanina izomerów. Ta izomeryczna zmienność może prowadzić do niespójnych pomiarów.

RatioWorks™ BCFL, wysokowydajna alternatywa dla BCECF

RatioWorks™ BCFL jest nowym wskaźnikiem ratiometrycznym opracowanym przez AAT Bioquest w celu przezwyciężenia słabej wydajności i zmienności izomerycznej BCECF. Podobnie do BCECF, RatioWorks™ BCFL ma pKa ∼7, maksimum absorpcji przy ∼ 503 nm i maksimum emisji przy ∼ 528 nm. Jednakże RatioWorks™ BCFL ma punkt izosbstyczny przy ∼ 454 nm. To przesunięcie ku czerwieni w jego punkcie izosbowym jest idealne do obrazowania ratiometrycznego, ponieważ umożliwia RatioWorks™ BCFL generowanie znacznie wyższego stosunku sygnału do szumu niż BCECF. Obrazowanie ratiometryczne RatioWorks™ BCFL sprawia, że określanie wewnątrzkomórkowego pH jest zasadniczo niezależne od kilku zmiennych czynników, w tym stężenia barwnika, długości ścieżki, wycieku komórkowego i szybkości fotobielenia. RatioWorks™ BCFL jest dostępny jako kwas nieprzepuszczający błon oraz jako reaktywny aminowo ester bursztynianowy do znakowania przeciwciał i białek.

Kluczowe cechy RatioWorks™ BCFL

-Odpowiedni do pomiarów pojedynczej długości fali i obrazowania ratiometrycznego wewnątrzkomórkowego pH
-Wyższy stosunek sygnału do szumu niż BCECF
-Ulepszona retencja komórkowa dla minimalnych zakłóceń tła
-Konstrukcja z pojedynczym izomerem zapewniająca bardziej spójne i powtarzalne wyniki
-Odpowiedni do mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i badań opartych na mikropłytkach fluorescencyjnych

Ratiometryczne fluorescencyjne wskaźniki pH dla środowisk o pH bliskim neutralnemu.

AAT Bioquest

Pomiary kwaśnego pH i endocytoza

Sondy kwasotropowe, takie jak PDMPO i AAT Bioquest Protonex™, posiadają unikalne właściwości, które są idealne do pomiaru pH kwaśnych organelli w żywych komórkach. Jako słaba zasada, barwniki te są w stanie selektywnie gromadzić się wewnątrz lizosomów i innych kwaśnych przedziałów w wyniku protonacji. Protonacja ta nie tylko redukuje zakłócenia tła, ale również aktywuje fluorescencję zależną od pH.

RatioWorks™ PDMPO, Ratiometryczny wskaźnik pH z podwójnym wzbudzeniem i podwójną emisją

RatioWorks™ PDMPO jest kwasotropową sondą pH o podwójnym wzbudzeniu i podwójnej emisji. Jego pKa ∼ 4,47 i unikalna fluorescencja zależna od pH jest idealnym połączeniem do pomiaru pH w organellach kwasowych. W warunkach zbliżonych do neutralnych RatioWorks™ PDMPO emituje intensywną niebieską fluorescencję przy ∼ 450 nm, gdy jest oświetlony przy maksimum wzbudzenia (∼ 333 nm). Jednakże, w środowiskach bardziej kwaśnych, fluorescencja ta szybko zmienia się na intensywnie żółtą przy długości fali ∼ 550 nm. RatioWorks™ PDMPO wykazuje również dodatkowe maksimum wzbudzenia przy ∼386 nm. Umożliwia to wykonywanie pomiarów wewnątrzkomórkowego pH na cytometrach przepływowych wyposażonych w laser fioletowy. RatioWorks™ PDMPO był z powodzeniem stosowany jako znacznik podczas biokrzemionkowania i znalazł szerokie zastosowanie w badaniach związanych z krzemionką. RatioWorks™ PDMPO jest również dostępny jako aminowy ester sukcynimidylowy do znakowania białek i przeciwciał oraz sprzężony z dekstranem do badania szlaków endocytarnych.

Barwniki Protonex™, kwasotropowe wskaźniki pH

Protonex™ Green 500 i Protonex™ Red 600 to nowe, czułe na pH barwniki fluorescencyjne, opracowane przez AAT Bioquest do monitorowania kwaśnych przedziałów komórkowych, takich jak endosomy i lizosomy, przy zmniejszonej zmienności sygnału i zwiększonej dokładności. W środowisku zbliżonym do neutralnego barwniki Protonex™ są zasadniczo niefluorescencyjne. Dopiero po ekspozycji na środowisko kwaśne intensywność fluorescencji barwników Protonex™ wzrasta. Optymalne maksima wzbudzenia i emisji barwnika Protonex™ Green 500 wynoszą odpowiednio ∼445 nm i ∼503 nm, natomiast barwnik Protonex™ Red 600 wzbudza przy ∼575 nm i emituje przy ∼597 nm. Barwniki Protonex™ są dostępne w postaci aminoreaktywnego estru sukcynimidylowego do znakowania białek i przeciwciał, jak również w postaci sprzężonej z dekstranem lub kulkami lateksowymi do badania szlaków endocytarnych.

Główne cechy barwników Protonex™

-Protonex™ Green 500 i Protonex™ Red 600 wykazują pKa ∼ 6,5.
-Barwniki Protonex™ są niefluorescencyjne w neutralnym pH i zwiększają intensywność emisji fluorescencji wraz z zakwaszeniem.
-Skuteczne w śledzeniu internalizacji w żywych komórkach i monitorowaniu szlaków fagocytotycznych i endocytotycznych
-Minimalna fluorescencja barwnika przy neutralnym pH eliminuje potrzebę etapów płukania
-Odpowiednie do analizy multipleksowej z innymi barwnikami fluorescencyjnymi i koniugatami
-Do stosowania z mikroskopem fluorescencyjnym, cytometrem przepływowym, fluorometrem i instrumentami o wysokiej zawartości.

Ratiometryczne i jednofalowe fluorescencyjne wskaźniki pH dla środowisk o kwaśnym pH.

AAT Bioquest