Wskaźniki wapnia

Badania przepływu wapnia w komórkach są szeroko stosowane w badaniach przesiewowych o dużej wydajności (HTS) w celu określenia pobudzenia i zahamowania sygnalizacji przez receptory sprzężone z białkami G (GPCRs), dużą rodzinę integralnych białek błonowych i ważną klasę docelową w odkrywaniu leków. Dokładne pomiary stężenia i mobilizacji wapnia wewnątrzkomórkowego pozwalają na pełniejsze zrozumienie szlaków sygnałowych regulowanych przez wapń, funkcji komórkowych i procesów patologicznych.

Firma AAT Bioquest opracowała największą kolekcję wskaźników wapnia, w tym Fluo-8®, Cal-520® i Calbryte™, jak również testy przepływu wapnia do śledzenia mobilizacji wapnia za pomocą intensywnych sygnałów fluorescencyjnych i w różnych opcjach długości fali od ultrafioletu do podczerwieni.

Ilościowe oznaczanie wapnia cytozolowego

Wapń jest wszechobecnym przekaźnikiem wpływającym na wiele szlaków transdukcji sygnału, w tym na indukowane wapniem zmiany w konfirmacji białek, regulację poziomu wapnia w cytozolu i organellach, wysoce zlokalizowaną naturę transdukcji sygnału pośredniczonego przez wapń i jego specyficzne role w pobudliwości, egzocytozie, motoryce, apoptozie i transkrypcji. Szlaki te regulują wiele kluczowych procesów komórkowych, w tym neurotransmisję, proliferację komórek i skurcz mięśni. W normalnych warunkach, w odniesieniu do płynu pozakomórkowego, spoczynkowe stężenie wapnia w cytoplazmie jest stosunkowo niskie, na poziomie lub poniżej 100 nM. Sygnalizacja wapniowa jest aktywowana albo poprzez uwolnienie jonów wapnia z magazynów wewnątrzkomórkowych, albo poprzez napływ wapnia zewnątrzkomórkowego przez kanały jonowe błony plazmatycznej. Stymulowane komórki mogą zwiększyć stężenie wapnia cytoplazmatycznego do 500-1000 nM.

Fluorescencyjne pochodne estrów AM do obrazowania wapnia w żywych komórkach

Wskaźniki fluorescencyjne, które wykazują reakcje spektralne po związaniu wapnia, umożliwiły naukowcom badanie zmian w wewnątrzkomórkowym stężeniu wolnego wapnia przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej, spektroskopii fluorescencyjnej i fluorescencyjnych czytników mikropłytek. Aby ułatwić wykrywanie wewnątrzkomórkowej mobilizacji wapnia i promować pasywną dyfuzję, grupy funkcyjne estru acetoksymetylowego (AM ester) są dołączane do struktury rdzenia wskaźników wapnia. Zwiększa to hydrofobowość wskaźnika, umożliwiając mu łatwe przenikanie przez nienaruszone błony plazmatyczne i zwiększa czułość wskaźnika poprzez minimalizację niespecyficznej fluorescencji tła, ponieważ wskaźniki sprzężone z estrami AM są zasadniczo niefluorescencyjne i nieaktywne.

Aktywność jest inicjowana w momencie wejścia sondy do żywej komórki i dopiero po usunięciu przez wewnątrzkomórkowe esterazy grup funkcyjnych estrów AM. Po aktywacji, sondy wykrywają wapń poprzez chelatowanie i reagują poprzez generowanie sygnału fluorescencyjnego w stosunku do stężenia wapnia. Wskaźniki takie jak Fluo-8®, AM (nr kat. 21080), Cal-520®, AM (nr kat. 21131) i Calbryte™ 520, AM (nr kat. 20653) są szeroko stosowane w obrazowaniu wapnia, badaniach przepływu wapnia i opartych na komórkach badaniach przesiewowych o dużej wydajności (HTS) w celu odkrywania leków. Wskaźniki wapnia są kompatybilne z cytometrią przepływową, mikroskopią fluorescencyjną i platformą mikropłytek fluorescencyjnych. Oprócz fluorescencyjnych i luminescencyjnych wskaźników wapnia, oferujemy również kilka niefluorescencyjnych cząsteczek sygnalizujących wapń i chelatory do pomiaru i manipulacji wapniem wewnątrzkomórkowym i zewnątrzkomórkowym.

Wskaźniki wapnia o pojedynczej długości fali

Wskaźniki wapniowe o pojedynczej długości fali są szeroko stosowane do monitorowania mobilizacji wapnia, obrazowania dynamiki przestrzennej sygnalizacji wapniowej oraz w przesiewowych badaniach farmakologicznych opartych na komórkach HTS, dotyczących sygnalizacji stymulowanej i hamowanej przez agonistów i antagonistów GPCRs. Wskaźniki te wykazują znaczące, zależne od wapnia zmiany intensywności fluorescencji przy nasyconym poziomie wapnia bez zmiany długości fali absorbancji lub emisji. Opracowaliśmy wiele nowych wskaźników wapnia, w tym serię Fluo-8®, serię Cal-520® i serię Calbryte™, zaprojektowanych do śledzenia mobilizacji wapnia z najjaśniejszym sygnałem fluorescencyjnym i zakresem długości fali oraz opcji powinowactwa, aby zaspokoić wiele zastosowań.

Kluczowe cechy wskaźników wapniowych o pojedynczej długości fali

-Minimalna fluorescencja tła przy spoczynkowych poziomach wapnia
-Ulepszony stosunek sygnału do tła
-Znacznie lepsza retencja komórkowa
-Formaty przenikające przez komórki do analizy wapnia w żywych komórkach (kompatybilne z obrazowaniem, cytometrią przepływową i analizami mikropłytkowymi, takimi jak HTS)
-Formaty nieprzepuszczające komórek do ładowania przez mikroiniekcję, pipetę płatkową lub ładowanie pinocytarne
-Formaty emitujące promieniowanie ultrafioletowe (UV), fioletowe i światło widzialne
-Formaty o niskim, średnim i wysokim powinowactwie zapewniają zakres czułości odpowiadający wielu zastosowaniom

Zielone fluorescencyjne wskaźniki wapnia do wykrywania wapnia wewnątrzkomórkowego

Wskaźniki wapnia Rhod o długiej długości fali do wykrywania wapnia wewnątrzkomórkowego

Ratiometryczne wskaźniki wapnia

W porównaniu do wskaźników jednopoziomowych, wskaźniki ratiometryczne (lub dwupoziomowe) posiadają unikalne właściwości spektralne, które są wyzwalane w odpowiedzi na wiązanie wapnia. Podczas wiązania z wapniem, wskaźniki ratiometryczne ulegają przesunięciu zarówno w ich optymalnej absorbancji jak i intensywności długości fali emisji. Na przykład, wskaźniki wapnia o podwójnym wzbudzeniu Fura-2, AM i Fura8 ™ Wzrost stężenia wapnia powoduje wzrost i spadek intensywności emisji fluorescencji wskaźnika o podwójnym wzbudzeniu, gdy wzbudzany jest odpowiednio przy długościach fali wzbudzenia szczytowego związanego i wolnego od wapnia.

Kluczowe cechy ratiometrycznych wskaźników wapnia

-Oznaczanie ratiometryczne zapewnia dokładny pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia
-Minimalizuje efekty nierównomiernego ładowania barwnika, wycieku barwnika, fotobielenia i różnej grubości komórek (powszechne w mieszanych populacjach).
-Zapewnia bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki
-Wskaźniki dostępne w formatach podwójnego wzbudzenia, podwójnej emisji lub podwójnego wzbudzenia i podwójnej emisji
-Dostępne jako estry AM przepuszczające membranę (kompatybilne z obrazowaniem, cytometrią przepływową i analizami mikropłytkowymi, takimi jak HTS)
-Dostępne jako nieprzepuszczalne dla błony pochodne soli do ładowania przez mikroiniekcję, pipetę łatkową lub ładowanie pinocytarne

Podwójnie wzbudzone ratiometryczne wskaźniki wapnia do obrazowania wapnia w żywych komórkach.