Transfer energii rezonansu Förstera (FRET)

Rezonansowy transfer energii fluorescencji (FRET) jest zależnym od odległości transferem energii pomiędzy dwoma chromoforami, donorem i akceptorem. Gdy znajdują się w bliskiej odległości, elektronowo wzbudzone chromofory donorowe mogą przekazywać energię w sposób niepromienisty do chromoforów akceptorowych poprzez wewnątrzcząsteczkowe, długozasięgowe interakcje sprzężenia dipol-dipol. W rezultacie, transfer energii powoduje wygaszenie intensywności fluorescencji donora i skrócenie jego czasu życia w stanie wzbudzonym, przy jednoczesnym zwiększeniu intensywności emisji chromoforu akceptora. Ponieważ wydajność FRET zależy od odwrotności szóstej potęgi separacji międzycząsteczkowej, jest to korzystna technika do badania różnych zjawisk biologicznych, które powodują zmiany w bliskości molekularnej, w tym interakcji receptor-ligand, dystrybucji przestrzennej i montażu kompleksów białkowych oraz detekcji potencjału membranowego.

AAT Bioquest oferuje szeroki asortyment par fluorescencyjnych donorów i akceptorów oraz niefluorescencyjnych barwników Tide Quencher™ i BXQ do konstruowania biosensorów opartych na metodzie FRET, a także peptydy FRET do badania aktywności proteaz koronawirusowych oraz bezzmywalne, czasowo rozdzielcze testy FRET do monitorowania aktywacji cyklazy adenylowej w systemach receptorów sprzężonych z białkami G.

Trzy podstawowe warunki dla FRET

Chociaż wiele czynników może wpływać na wydajność FRET, trzy podstawowe warunki muszą być spełnione, aby FRET mógł wystąpić.

– Cząsteczki donora i akceptora muszą znajdować się w bliskiej odległości od siebie, zwykle 10-100 Å (1-10 nm). Wydajność FRET (E) jest określona równaniem E = R0⁶/(R0⁶ + r⁶), gdzie R0 jest promieniem Förstera, a r jest rzeczywistą odległością pomiędzy cząsteczkami donora i akceptora. Promień Förstera to odległość, przy której 50% energii wzbudzenia jest przenoszone z donora do akceptora, a wartość R0 zwykle mieści się w przedziale 10-100Å. Pary FRET o wartości R0 w wyższej części tego zakresu są często preferowane ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo wystąpienia FRET.

– Widmo absorpcji lub wzbudzenia akceptora musi nakładać się na widmo emisji fluorescencji donora (Rysunek 1). Stopień, w jakim widma te nakładają się na siebie jest określany jako całka widmowa nakładania (Jλ, obszar zacieniony na szaro). Im większy stopień Jλ, tym większe prawdopodobieństwo wystąpienia FRET.

– Orientacje dipoli przejściowych donora i akceptora muszą być w przybliżeniu równoległe.

Variable	Definition
FD(λ)	Is the corrected fluorescence intensity of the donor in the wavelength range λ to λ+∆λ with the total intensity (area under the curve) normalized to unity
εA	Is the extinction coefficient of the acceptor at λ in units of M-1cm-1
λ	Is the wavelength in nm

Wybieranie par Donor/Akceptor FRET