Glutation (GSH i GSSG)

Glutation (GSH) jest trójpeptydem składającym się z trzech aminokwasów: L-cysteiny, kwasu L-glutaminowego i glicyny. Bierze udział w tworzeniu i utrzymaniu wiązań disiarczkowych w białkach, transporcie aminokwasów przez błony komórkowe oraz w detoksykacji. Ponieważ glutation zawiera grupę tiolową, służy jako główny endogenny antyoksydant w komórkach, zapobiegając uszkodzeniom poprzez neutralizację reaktywnych form tlenu, takich jak wolne rodniki i nadtlenki. Monitorowanie zredukowanego i utlenionego glutationu w próbkach biologicznych jest użytecznym narzędziem do oceny statusu redoks i detoksykacji komórek i tkanek przed uszkodzeniem oksydacyjnym i wywołanym przez wolne rodniki. Chociaż w handlu dostępnych jest kilka odczynników i zestawów do ilościowego oznaczania glutationu, to na ich niekorzyść przemawia brak czułości i żmudne protokoły. Amplite™ Fluorimetric Glutathione assay oferuje wygodną i bardzo czułą metodę ilościowego oznaczania glutationu w próbkach biologicznych.

Amplite™ Fluorymetryczny test do oznaczania glutationu

Test Amplite™ do fluorymetrycznego oznaczania glutationu jest czułą, jednoetapową metodą fluorymetryczną, umożliwiającą wykrycie zaledwie 1 pikomola GSH w 100 µL objętości testu. Test ten wykorzystuje opatentowany, niefluorescencyjny i zależny od pH sensor glutationu, który staje się silnie fluorescencyjny po wejściu w reakcję z tiolem. Test może być przeprowadzony w wygodnym formacie płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych lub 384-dołkowych i jest łatwo przystosowany do automatyzacji bez etapu separacji. Sygnał fluorescencji może być łatwo wykryty za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek przy Ex/Em = 490/520 nm.

Stosunek glutationu GSH/GSSG

W zdrowych komórkach i tkankach glutation występuje w dwóch stanach: zredukowanym (GSH) i utlenionym (GSSG). W stanie zredukowanym GSH jest głównym antyoksydantem tkankowym, który neutralizuje reaktywne formy tlenu. W wyniku oddania elektronu, GSH staje się reaktywny i łatwo wchodzi w reakcje z innymi reaktywnymi cząsteczkami GSH, tworząc GSSG. Ponadto, zredukowany GSH dostarcza równoważników redukujących dla katalizowanej przez peroksydazę glutationową (GPx) redukcji wodoronadtlenków lipidów do odpowiadających im alkoholi oraz nadtlenku wodoru do wody. W reakcji katalizowanej przez GPx, w wyniku utworzenia wiązania disulfidowego pomiędzy dwoma cząsteczkami GSH powstaje GSSG. Enzym reduktaza glutationowa (GR) przekształca GSSG w GSH, jednocześnie utleniając fosforan dinukleotydu β-nicotynamidu adeninowego (β-NADPH2).

Monitorowanie zredukowanego GSH i jego stosunku do utlenionego GSSG może być wykorzystane do oceny statusu redoks i detoksykacji komórek i tkanek w odniesieniu do ochronnej roli glutationu przed oksydacyjnym i wolnorodnikowym uszkodzeniem komórek. W normalnych warunkach, para redoks GSH w komórkach ssaków typowo waha się w stężeniu od 1 – 10 nM, przy czym stosunek molowy GSH:GSSG w komórkach w stanie spoczynku przekracza 100:1. Gdy komórki są narażone na zwiększone poziomy stresu oksydacyjnego, GSSG gromadzi się, a stosunek GSH/GSSG zmniejsza się do wartości tak niskich jak 10:1, a nawet 1:1. W związku z tym, monitorowanie poziomu GSH/GSSG w próbkach biologicznych stało się użytecznym narzędziem w ocenie stresu oksydacyjnego komórek i tkanek oraz uszkodzeń komórek spowodowanych przez wolne rodniki.

Amplite™ Testy stosunku glutationu GSH/GSSG

Zestawy AAT Bioquest Amplite™ Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio Assay i Amplite™ Rapid Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio Assay są prostymi i ultraczułymi testami do ilościowego oznaczania zaledwie 1 pikomola GSH (lub cysteiny) w 100 µL objętości testowej. Każdy zestaw wykorzystuje opatentowany sensor niefluorescencyjny, który staje się silnie fluorescencyjny po reakcji z GSH, a jego sygnał może być wykryty przy użyciu fluorescencyjnego czytnika mikropłytek przy Ex/Em = 490/520 nm. Testy mogą być wykonywane w wygodnym formacie płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych lub 384-dołkowych i są łatwo przystosowane do automatyzacji bez etapu separacji. Różnica pomiędzy tymi testami polega na rozpuszczalności czujnika. Test Amplite™ Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio wykorzystuje sensor Thiolite™ Green, który jest rozpuszczalny w DMSO. W teście Amplite™ Rapid Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio zastosowano rozpuszczalny w wodzie sensor Thiolite™ Green 520WS.