Biotyna i streptawidyna

Kompleks biotyna-streptawidyna jest jednym z najbardziej popularnych systemów znakowania służących do koniugacji biomolekuł, takich jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe, a także cząsteczek syntetycznych, takich jak etykiety fluorescencyjne. Odniósł on duży sukces w dziedzinie przygotowywania próbek jako podstawowa część wielu systemów oczyszczania i odgrywa kluczową rolę w wielu systemach detekcji w takich instrumentach jak mikroskopia i cytometria przepływowa.

Biotin-Streptavidin Conjugation System

 

Powszechne zastosowanie systemu koniugacji biotyna-streptawidyna wynika przede wszystkim z dwóch czynników. Pierwszym z nich jest stosunkowo niewielki rozmiar samych cząsteczek biotyny i streptawidyny, który pozwala na szerokie wiązanie się z biologicznie aktywnymi makrocząsteczkami, takimi jak przeciwciała, bez zakłócania ich funkcji (tj. miejsca wiązania przeciwciał). Drugim aspektem jest specyficzność, z jaką biotyna i streptawidyna wiążą się ze sobą, jak również siła późniejszego wiązania, co pozwala na wydajne, usprawnione zastosowania w testach biologicznych. Tetramery streptawidyny wykazują niezwykle wysokie powinowactwo wiązania do biotyny ze stałą dysocjacji (Kd) wynoszącą około ∼10-14 mol/L. To ścisłe i specyficzne wiązanie jest szybkie i specyficzne. To ścisłe i specyficzne wiązanie jest szybkie i odporne na skrajne wartości pH, temperatury, rozpuszczalników organicznych i odczynników denaturujących.

Ilustracja interakcji streptawidyna-biotyna. Wielowartościowe właściwości streptawidyny pozwalają jej na wiązanie do czterech cząsteczek biotyny z wysokim stopniem powinowactwa. Biotyna jest zazwyczaj sprzężona z enzymem, przeciwciałem lub białkiem docelowym.

Zalety systemu biotyna-streptawidyna

Kluczową zaletą systemu biotyna-streptawidyna jest jego zdolność do poprawy czułości wykrywania. Wynika to w dużej mierze z tetramerycznej konformacji streptawidyny. Jedno białko streptawidyny ma zdolność wiązania czterech cząsteczek biotyny z wysokim powinowactwem i selektywnością. Ta mnogość umożliwia wzmocnienie słabych sygnałów i poprawia czułość detekcji dla celów o średniej i niskiej liczebności w komórkach lub tkankach ssaków przy prostym przebiegu pracy.

Inną kluczową korzyścią jest wszechstronność systemu biotyna-streptawidyna. Ponieważ streptawidyna może być sprzężona z różnymi znacznikami reporterowymi, można ją łatwo włączyć do praktycznie każdego testu immunologicznego. Na przykład, enzymatyczne koniugaty streptawidyny są szeroko stosowane w enzymatycznych testach immunosorbcyjnych (ELISA), podczas gdy znakowana fluorescencyjnie streptawidyna, taka jak streptawidyna iFluor™ 488, jest szeroko stosowana w znakowaniu powierzchni komórek, sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) i innych zastosowaniach obrazowania fluorescencyjnego.

Zastosowania

  • Testy immunologiczne ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
  • Immunohistochemia (IHC)
  • Wzmocnienie sygnału Power Styramide™, doskonały zamiennik tyramidu
  • Immunoblotting
  • Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
  • Cytometria przepływowa
  • Mikroskopia immunofluorescencyjna
  • Znakowanie powierzchni komórek
  • Oczyszczanie powinowactwa

Biotyna

Biotyna jest małą, 244-daltonową cząsteczką haptenu. Jej wyjątkowo silne powinowactwo wiązania do streptawidyny jest powszechnie wykorzystywane do wykrywania i monitorowania celów biologicznych. Biotyna wykazuje dwie cechy, które czynią ją idealną do opracowywania biokoniugatów. Pierwszą z nich jest stosunkowo niewielki rozmiar biotyny. Pozwala to na znakowanie wielu znaczników biotyny do pojedynczego białka lub przeciwciała bez znaczącego wpływu na ich reaktywność biologiczną. Po drugie, łańcuch boczny kwasu walerianowego w cząsteczce biotyny. Łańcuch ten może być derywatyzowany w celu ułatwienia przyłączania różnych grup reaktywnych używanych do chemicznego znakowania biotyny do białek bez zmiany powinowactwa biotyny do streptawidyny.

AAT Bioquest oferuje biotynylowane przeciwciała drugorzędowe, białka, nukleotydy i inne małe cząsteczki do stosowania w technikach amplifikacji opartych na streptawidynie. W przypadku testów, w których nie jest dostępna sonda biotyny, oferujemy wiele odczynników i zestawów do biotynowania, które umożliwiają badaczom chemiczne znakowanie białek, kwasów nukleinowych i materiałów powierzchniowych w celu uzyskania niestandardowych odczynników biotynylowanych.

Fluorescent Biotin Derivatives

Fluorescencyjne pochodne biotyny zawierają zarówno fluorofor jak i cząsteczkę biotyny w tej samej cząsteczce. Odczynniki te są stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania białek wiążących biotynę metodą fluorescencyjną. Silne wygaszanie związane z wiązaniem streptawidyny z fluorescencyjną biotyną może być wykorzystane do precyzyjnego pomiaru stężenia streptawidyny (lub awidyny).

AAT Bioquest

Biotynowane przeciwciała drugorzędowe

AAT Bioquest oferuje biotynylowane przeciwciała drugorzędowe do stosowania z technikami amplifikacji opartymi na streptawidynie. Kluczową zaletą stosowania biotynylowanych przeciwciał drugorzędowych jest elastyczność w stosowaniu tego samego przeciwciała drugorzędowego w wielu aplikacjach, poprzez proste użycie innego koniugatu streptawidyny.

Łatwo dostępne koniugaty streptawidyny

  • HRP-streptawidyna (obrazowanie wymaga substratu HRP)
  • AP-streptawidyna (obrazowanie wymaga substratu AP)
  • iFluor™ – streptawidyna
  • mFluor™ – streptawidyna
  • APC, PE i tandemowe barwniki-streptawidyny (intensywna jasna fluorescencja i szybkie fotobielenie fitobiliprotein są doskonałe do zastosowań w cytometrii przepływowej)

 

AAT Bioquest

Barwienie immunofluorescencyjne α-tubuliny w komórkach HeLa.
Barwienie immunofluorescencyjne α-tubuliny w komórkach HeLa. α-tubulina w utrwalonych i permeabilizowanych komórkach HeLa była znakowana pierwotnym przeciwciałem króliczym antytubuliną, a następnie inkubowana z biotynylowaną kozią IgG anty-rabbitową (H&L).

Biotynowane nukleotydy

Analogi trifosforanów nukleozydów modyfikowane biotyną, takie jak dUTP i dCTP, mogą być enzymatycznie wbudowywane do fragmentów DNA lub RNA w celu wykorzystania w hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH), tablicach DNA, mikromacierzach i innych technikach hybrydyzacji. Standardowe enzymatyczne, nieradioaktywne reakcje znakowania DNA, w tym znakowanie 3”-końca, znakowanie cDNA, translacja nickowa, PCR i znakowanie random prime. Każdy biotynowany nukleotyd zawiera 11-, 14-, 16- lub 20-atomowy odstęp pomiędzy biotyną a punktem jej przyłączenia na nulceotydzie. Ułatwia to jego detekcję i wzmocnienie sygnału przez fluorofor i enzymatyczne koniugaty streptawidyny lub kulki agarozowe i magnetyczne.

AAT Bioquest

Aminokwasy biotynylowane

Biotynylowane peptydy są odpowiednie do badań immunodetekcyjnych i biomedycznych testów przesiewowych, które wymagają unieruchomienia na płytkach mikromiareczkowych, kulkach lub membranach pokrytych streptawidyną lub awidyną. Biotyna może być przyłączona do N-końca peptydów lub do łańcuchów bocznych lizyny (Lys), kwasu glutaminowego (Glu) lub kwasu asparaginowego (Asp) podczas syntezy w fazie stałej Fmoc. Wbudowanie PEG-spacer zarówno w FMOC-Glu(biotinyl-PEG)-OH jak i FMOC-Asp(biotinyl-PEG)-OH zmniejsza przeszkodę steryczną pomiędzy docelowym peptydem a streptawidyną, co prowadzi do lepszego wiązania biotyny. Hydrofilowa natura PEG-spacer minimalizuje niespecyficzne interakcje i poprawia rozpuszczalność odczynnika i biotynylowanego peptydu.

AAT Bioquest

Pochodne reaktywnej biotyny

Reaktywne pochodne biotyny zawierają reaktywne cząsteczki, takie jak estry sukcynimidylu lub maleimidy, które ułatwiają znakowanie biotyny na białkach, przeciwciałach i innych makrocząsteczkach. Przy wyborze reaktywnej pochodnej biotyny należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:

  • Ukierunkowanie na grupę funkcyjną – specyficzne reaktywne cząsteczki są ukierunkowane i wiążą się z odpowiednimi grupami funkcyjnymi w celu ukierunkowanej lub nieselektywnej biotynacji białek i innych makrocząsteczek (np. estry sukcynimidowe ukierunkowane są na pierwszorzędowe aminy, a maleimidy na grupy tiolowe lub sulfhydrylowe).
  • Rozpuszczalność – ma wpływ na biotynowanie docelowego białka lub makrocząsteczki.
  • Długość ramion dystansowych (PEG) – zwiększa wrażliwość na wykrywanie docelowego białka i zmniejsza przeszkody steryczne.

AAT Bioquest

Odczynniki do biotynylacji ReadiView™

Określenie stopnia biotynylacji białka jest dość trudne, ponieważ absorpcja biotyny jest trudna do wykrycia w białkach i kwasach nukleinowych. Aby ułatwić to oznaczenie, oferujemy serię chromoforowych, reaktywnych pochodnych biotyny, ReadiView™ biotin. Te nowatorskie odczynniki do biotynowania zawierają specjalnie zaprojektowany „kolorowy znacznik (CT)” optymalnie umieszczony pomiędzy dwoma ramionami dystansowymi. Ramiona dystansowe zmniejszają przeszkody steryczne i poprawiają rozpuszczalność w wodzie, a znacznik CT umożliwia łatwe określenie stopnia biotynowania poprzez obliczenie stosunku absorpcji 280 nm/385 nm. Znacznik CT nie wpływa na kompleksowanie biotyny ze streptawidyną i ma minimalny wpływ na wygaszanie fluorescencyjnych koniugatów streptawidyny. Biotyna ReadiView™ jest dostępna w formatach: aminoreaktywnym, tioloreaktywnym i click-chemistry.

Ester sukcynimidylowy biotyny ReadiView™

AAT Bioquest

ReadiViewâ„¢ biotin acid
ReadiViewâ„¢ biotin acid
Numer Katalogowy: 3050
AAT Bioquest
2005.92 PLN

Koniugaty streptawidyny znakowane enzymami

Enzymatycznie znakowane koniugaty streptawidyny są powszechnie stosowane w enzymatycznym teście immunosorbcyjnym (ELISA), immunohistochemii, immunoblottingu i technikach hybrydyzacji in situ. Enzymy peroksydaza chrzanowa (HRP) i fosfataza alkaliczna (ALP) są szeroko stosowane jako znaczniki reporterowe ze względu na ich wysoki wskaźnik obrotu, stabilność, łatwość koniugacji i niski koszt.

Aby zmaksymalizować zachowanie aktywności zarówno enzymu, jak i białka, nasze koniugaty HRP-streptawidyna i AP-streptawidyna są przygotowywane w stosunku 1:1 (enzym do streptawidyny). Dla tych koniugatów enzymatycznych dostępne są chromogenne, fluorogenne i chemiluminescencyjne stubstraty.

Wykrywanie IHC EpCAM w tkance FFPE gruczolakoraka płuc.

AAT Bioquest

AAT Bioquest

Fluorescencyjne koniugaty streptawidyny

Fluorescencyjne koniugaty streptawidyny są szeroko stosowane w obrazowaniu fluorescencyjnym do wykrywania biotynylowanych przeciwciał, ligandów i sond DNA w technikach hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i wielokolorowej cytometrii przepływowej. Oferujemy kompleksowe portfolio fluorescencyjnych streptawidyn znakowanych barwnikami iFluor™, mFluor™, fitobiliproteinami, barwnikami tandemowymi i innymi. Zalety naszych koniugatów streptawidyny iFluor™ obejmują wyjątkowo jasną fluorescencję, doskonałą fotostabilność i fluroescencję niewrażliwą na pH w szerokim zakresie molowym.

Koniugaty iFluor™ streptawidyny

Koniugaty streptawidyny znakowane barwnikami iFluor™ wykazują wyjątkowo jasną i fotostabilną fluorescencję, przewyższającą Alexa Fluor® i inne spektralnie podobne koniugaty. Koniugaty streptawidyny iFluor™ są przeznaczone do stosowania w różnych zastosowaniach związanych z analizą komórek i białek, w tym do obrazowania, cytometrii przepływowej i fluorescencyjnego western blottingu. Jako środek ostrożności należy unikać stosowania niebiesko fluorescencyjnych koniugatów streptawidyny podczas wykrywania celów o niskiej liczebności. Niebieskie barwniki fluorescencyjne mają niższą fluorescencję i mogą wykazywać wyższe tło niespecyficzne niż inne barwniki.

Barwienie immunofluorescencyjne &alpha-tubuliny w komórkach HeLa.
Barwienie immunofluorescencyjne &alpha-tubuliny w komórkach HeLa. &alpha-tubulinę w utrwalonych i permeabilizowanych komórkach HeLa inkubowano z króliczym przeciwciałem pierwotnym antytubuliny, następnie inkubowano z biotynylowanym kozim anty-rabbitowym IgG (H&L) (nr kat. 16794), a następnie wizualizowano koniugatem iFluor™ 647-streptawidyny (nr kat. 16966. Jądra komórkowe zostały przeciwbarwione przy użyciu DAPI (nr kat. 17507).

AAT Bioquest

Koniugaty streptawidyny mFluor™ do cytometrii przepływowej

Koniugaty streptawidyny znakowane barwnikami mFluor™ wykazują minimalne samowzmacnianie, dając intensywnie fluorescencyjne i fotostabilne koniugaty do cytometrii przepływowej. Koniugaty streptawidyny mFluor™ są zaprojektowane do optymalnego wzbudzania przez jedną z głównych linii laserowych powszechnie stosowanych w cytometrach przepływowych, takich jak linie laserowe 405 nm, 488 nm, 532 nm, 561 nm lub 633 nm.

Analiza cytometryczna przepływu komórek HL-60 barwionych (czerwono) lub bez (zielono) 1ug/ml anty-ludzkim HLA-ABC-Biotyną, a następnie koniugatem mFluor™ Blue 570 ze streptawidyną (nr kat. 16935).

AAT Bioquest

Streptawidyna APC, PE, PerCP i tandemowe koniugaty barwnikowe do cytometrii przepływowej

Koniugaty streptawidyny PE, APC i PerCP są powszechnie stosowane w aplikacjach, które wymagają wysokiej czułości, ale nie phostabilności, głównie w cytometrii przepływowej, FACS, immunofenotypowaniu i mikromacierzach. Niezwykle jasna fluorescencja fitobiliprotein wynika z ich niezwykle wysokich współczynników ekstynkcji i wydajności kwantowej.

Tandemowe koniugaty barwników stanowią kompromis między fitobiliproteiną donorem (np. APC lub PE) znakowaną akceptorem iFluor™, który emituje fluorescencję o większej długości fali. Wykorzystując rezonansowy transfer energii fluorescencji (FRET), światło zaabsorbowane przez fitobiliproteinę donora powoduje emisję fluorescencji akceptora. W cytometrii przepływowej barwniki tandemowe idealnie nadają się do wielobarwnej analizy parametrycznej komórek ze względu na wykorzystanie jednego źródła wzbudzenia i znacznie większe przesunięcia Stokesa.

AAT Bioquest

Koniugaty Streptawidyna-Xtra™

Optymalny stopień znakowania koniugatów Streptavidin-Xtra™ iFluor™ pozwala uzyskać najjaśniejsze fluorescencyjne koniugaty streptawidyny do wykrywania biotynylowanych przeciwciał w obrazowaniu komórek, cytometrii przepływowej i aplikacji western blot. Koniugaty Streptavidin-Xtra™ iFluor™ obrazują cele o niskiej zasobności z większą czułością i szczegółowością w porównaniu z tradycyjnymi koniugatami streptawidyny Alexa Fluor®.

Zalety

  • Jasna i fotostabilna fluorescencja bez znaczącego samowzmacniania
  • Wysoki stosunek sygnału do szumu: 3∼5-krotna poprawa sygnału w porównaniu z Alexa Fluor®.
  • Fluroescencja niewrażliwa na pH w szerokim zakresie molowym
Comparison of HeLa cells stained with Streptavidin-Xtra™ IF488 and Streptavidin-Alexa Fluor® 488.HeLa cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 minutes, permeabilized with 0.02% Triton™ X-100 for 10 minutes, blocked with 1% BSA for 1 hour and labeled with 1 µg/mL α-tubulin Mouse mAb for 1 hour at room temperature. Biotinylated goat anti-mouse IgG (H+L) (Cat No. 16729) was used for detection α-tubulin and visualized with Streptavidin-Xtra™ iFluor 488 (Cat No. 46001) and Streptavidin-Alexa Fluor® 488. Cells were counterstained with Hoechst 33342 (Cat No. 17535).
Comparison of HeLa cells stained with Streptavidin-Xtra™ IF488 and Streptavidin-Alexa Fluor® 488.HeLa cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 minutes, permeabilized with 0.02% Triton™ X-100 for 10 minutes, blocked with 1% BSA for 1 hour and labeled with 1 µg/mL α-tubulin Mouse mAb for 1 hour at room temperature. Biotinylated goat anti-mouse IgG (H+L) (Cat No. 16729) was used for detection α-tubulin and visualized with Streptavidin-Xtra™ iFluor 488 (Cat No. 46001) and Streptavidin-Alexa Fluor® 488. Cells were counterstained with Hoechst 33342 (Cat No. 17535).

AAT Bioquest

Inni dostawcy:

1