Real-Time PCR (qPCR)

PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy) jest podstawową techniką wykorzystywaną w badaniach z zakresu biologii molekularnej do szybkiej amplifikacji określonego wzorca DNA in vitro. Umożliwia ona naukowcom generowanie znacznych ilości próbki DNA do szerokiego zakresu zastosowań laboratoryjnych i klinicznych, w tym klonowania, genotypowania, sekwencjonowania, mutagenezy, kryminalistyki oraz wykrywania patogenów w diagnostyce chorób zakaźnych. Od czasu wprowadzenia w 1985 roku, opracowano kilka iteracji procesu PCR, w tym ilościowy PCR (qPCR) do monitorowania amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym oraz PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) do wykrywania RNA, narzędzia, które stało się kluczowe w diagnostyce wirusów.

W celu dokładnej i czułej detekcji PCR, AAT Bioquest oferuje kompleksowe portfolio barwników referencyjnych PCR, trifosforanów deoksynukleotydów, barwników wiążących dwuniciowe DNA oraz fluorescencyjnych barwników reporterowych i niefluorescencyjnych wygaszaczy do rozwoju sekwencyjnie specyficznych sygnalizatorów molekularnych.

Podstawowe zasady qPCR

W qPCR stosowana jest ta sama procedura amplifikacji, co w konwencjonalnym PCR. Odcinek docelowego DNA, który służy jako szablon, jest łączony w pojedynczej probówce wraz z innymi składnikami niezbędnymi do reakcji amplifikacji (np. termostabilne polimerazy DNA, startery do przodu i do tyłu, trifosforany deoksynukleotydów (dNTPs) i bufor reakcyjny). Tak przygotowaną probówkę umieszcza się w urządzeniu, zwanym termocyklerem. Termocykler jest urządzeniem laboratoryjnym, które zazwyczaj posiada blok termiczny z otworami, do których wkłada się probówki z mieszaniną reakcyjną PCR. Zawartość reakcji jest następnie poddawana serii etapów zależnych od czasu i temperatury – denaturacji, annealingu primera i przedłużenia (patrz Tabela 1) – Ta seria etapów jest powtarzana 25 do 30 razy, co prowadzi do wykładniczej amplifikacji szablonu DNA.

Przegląd podstawowych kroków w cyklicznej reakcji qPCR

Krok	Temperatura	Czas	Proces
Denaturacja	95°C	∼20 to 30 sekund	Szablon dwuniciowego DNA (dsDNA) jest podgrzewany do wysokiej temperatury. Powoduje to przerwanie wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi parami zasad, przez co dsDNA rozdziela się na jednoniciowe DNA (ssDNA). Notka: Wymagany czas denaturacji może się wydłużyć, jeśli zawartość GC w szablonie jest stosunkowo wysoka.
Primer Annealing	48 to 72°C	∼20 to 40 sekund	Po denaturacji, temperatura reakcji jest obniżana do ∼48 do 72°C. Sprzyja to wiązaniu się primerów forward i reverse do każdego z szablonów ssDNA oraz późniejszemu wiązaniu się polimeraz DNA do hybrydy primer-templat. Notka: Krytyczne jest określenie właściwej temperatury dla etapu annealingu, aby zapewnić optymalną wydajność i specyficzność. Typowa temperatura wyżarzania wynosi ~5°C poniżej temperatury topnienia (Tm) primera.
Rozszerzenie	68 to 72°C	∼1 to 2 minut	Po annealingu temperatura reakcji jest podnoszona do ∼68 do 72°C. Umożliwia to polimerazie DNA wydłużenie primerów, syntezę nowych nici DNA komplementarnych do wzorca ssDNA w kierunku 5′ do 3′.