PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) jest podstawową techniką molekularną zaprojektowaną do wykrywania i ilościowego oznaczania całkowitego RNA lub messenger RNA (mRNA), z wysokim stopniem czułości i dokładności. W tej zmodyfikowanej wersji standardowego procesu PCR, mRNA, który służy jako początkowy szablon, jest najpierw odwrotnie transkrybowany do komplementarnego DNA (cDNA), a następnie amplifikowany poprzez PCR do dalszej analizy. W porównaniu z innymi technikami pomiaru mRNA, takimi jak analiza Northern blot, testy ochrony przed RNAse lub hybrydyzacja in situ, RT-PCR jest znacznie bardziej niezawodny w wykrywaniu transkryptu RNA dowolnego genu, niezależnie od jego względnej liczebności. W konsekwencji, RT-PCR jest szeroko stosowana do ilościowego badania ekspresji genów, badania wariantów transkryptów oraz generowania szablonów cDNA do klonowania i sekwencjonowania. Co więcej, RT-PCR stała się instrumentalnym narzędziem diagnostycznym do wykrywania patogenów, w tym wirusów wywołujących wirusy Ebola, HIV i nową chorobę koronawirusową (Covid-19).

Zasady PCR z odwrotną transkrypcją

W celu zastosowania PCR do badania RNA, próbka RNA musi być najpierw poddana procesowi odwrotnej transkrypcji w celu wygenerowania cDNA, przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy. Ta zależna od RNA polimeraza DNA, przy udziale starterów odwrotnej transkrypcji, deoksynukleotydów (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP i dCTP) oraz kofaktorów enzymatycznych, katalizuje syntezę cDNA z odpowiedniej sekwencji docelowego RNA. Powstały cDNA jest następnie używany jako matryca do amplifikacji PCR, a w zależności od sposobu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji i PCR proces ten można sklasyfikować jako jednoetapowy RT-PCR lub dwuetapowy RT-PCR.

Deoksynukleotydy (dNTPs) do stosowania w PCR, PCR w czasie rzeczywistym i PCR z odwrotną transkrypcją

Jednoetapowy RT-PCR

W jednoetapowym RT-PCR, odwrotna transkrypcja (tj. synteza cDNA) i PCR są przeprowadzane w tym samym naczyniu reakcyjnym i buforze. Ta prosta i wygodna konstrukcja pojedynczej probówki sprawdza się przy wykonywaniu niewielkiej liczby oznaczeń i jest przystosowana do szybkich zastosowań o dużej przepustowości. W jednoetapowym RT-PCR, do kierowania zarówno syntezą, jak i amplifikacją cDNA wymagane są specyficzne sekwencyjnie primery. Ponieważ specyficzne primery łatwiej ulegają annegacji w wyższych temperaturach reakcji niż primery losowe, najlepiej jest wykorzystywać odwrotne transkryptazy o wysokiej stabilności termicznej podczas stosowania tego podejścia.

Chociaż jednoetapowe podejście RT-PCR oferuje kilka zalet, nie jest pozbawione zastrzeżeń. Ponieważ zarówno odwrotna transkrypcja jak i PCR odbywają się w tej samej probówce, warunki reakcji nie mogą być oddzielnie optymalizowane, co może w różnym stopniu wpływać na wydajność lub efektywność reakcji. Ponadto, ponieważ cały zsyntetyzowany cDNA jest zużywany w kolejnym etapie PCR, wymagane są dodatkowe podwielokrotności oryginalnej próbki (próbek) RNA w celu powtórzenia reakcji lub oceny ekspresji innych genów.

 

One-Step RT-PCR
Primery RT	Startery specyficzne dla genów
Zalety	Szybka konfiguracja i minimalna obsługa próbek Pojedyncza reakcja w zamkniętej probówce eliminuje możliwość kontaminacji pomiędzy odwrotną transkrypcją a PCR Mniejsza liczba manipulacji pipetowaniem minimalizuje potencjalne błędy Łatwe przetwarzanie wielu próbek dla powtarzalnych testów lub badań przesiewowych o wysokiej wydajności Poprawa odtwarzalności danych
Wady	Należy powtórzyć lub zachować podwielokrotność RNA i przeprowadzić nową RT, aby przeanalizować nowy cel lub powtórzyć amplifikację. Warunki reakcji nie są optymalne – wpływa to na wydajność, a tym samym na kwantyfikację Dimery w primerach większym potencjalnym problemem Mniej wrażliwy niż dwuetapowy, ponieważ warunki reakcji są kompromisem pomiędzy dwiema połączonymi reakcjami Wykrywanie mniejszej liczby celów na próbkę
Idealne zastosowania	Praca z wieloma próbkami RNA w celu amplifikacji tylko kilku celów/li> Aplikacje o wysokiej wydajności Wielokrotne przeprowadzanie badań

Dwuetapowa RT-PCR

W dwuetapowym RT-PCR, odwrotna transkrypcja i PCR są przeprowadzane w oddzielnych naczyniach reakcyjnych z różnymi buforami, warunkami reakcji i strategiami primingu. Zamiast stosowania wyłącznie primerów specyficznych dla danego genu, jak w metodzie jednoetapowej, dwuetapowa RT-PCR jest przeprowadzana przy użyciu mieszaniny losowych heksamerów, primerów oligo-dT i/lub primerów specyficznych dla danego genu, co zapewnia pełne archiwum cDNA wszystkich gatunków RNA w próbce. Ponadto, rozłączenie odwrotnej transkrypcji i PCR pozwala na indywidualną optymalizację każdej reakcji w celu uzyskania maksymalnej wydajności i reprezentacji sekwencji. Pozwala to na uzyskanie większej wydajności cDNA podczas odwrotnej transkrypcji i daje możliwość przechowywania próbek cDNA do przyszłych reakcji amplifikacji lub dalszych zastosowań.

Podczas gdy dwuetapowe RT-PCR jest wysoce czułe, jest ono znacznie bardziej czasochłonne i mniej podatne na szybkie, wysokowydajne zastosowanie niż jednoetapowe RT-PCR. Wymaga on dodatkowego etapu w otwartej probówce, większej ilości pipetowania i manipulowania próbkami, co może zwiększać zmienność i ryzyko kontaminacji.

 

Dwustopniowa RT-PCR
Primery RT	Startery oligo(dT) Startery z losowym heksamerem Startery specyficzne dla genów Mieszanka wszystkich trzech
Zalety	Wybór primerów RT Elastyczna optymalizacja reakcji dla maksymalnej wydajności Możliwość przeprowadzenia wielu reakcji PCR na tej samej próbce cDNA Większa elastyczność przy oddzielnym wyborze enzymów RT i polimeraz DNA do PCR Możliwość przechowywania cDNA do wykorzystania w przyszłości Idealna metoda dla zastosowań z ograniczoną ilością materiałów wyjściowych
Wady	Wymaga więcej czasu na konfigurację, pracy i obsługi maszyny Dodatkowe czynności w otwartej probówce i pipetowanie zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia błędów eksperymentalnych i zanieczyszczeń Zużywa więcej odczynników Wymaga więcej optymalizacji niż jednoetapowe
Idealne zastosowania	Amplifikacja wielu celów z jednego źródła RNA Jeśli planujesz przechowywać cDNA do dodatkowych amplifikacji lub ponownego użycia w przyszłości

Pomiar amplikonów RT-PCR

Istnieją dwa podstawowe podejścia do pomiaru generowania amplikonów w RT-PCR. Pierwsze podejście analizuje amplifikację amplikonu po zakończeniu wszystkich cykli PCR i jest określane jako końcowe RT-PCR. Drugie podejście mierzy stężenie amplikonu w czasie rzeczywistym w trakcie procesu cyklicznego PCR i jest znane jako RT-PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowe RT-PCR (RT-qPCR). W RT-qPCR do wykrywania generowania amplikonów w czasie rzeczywistym można użyć kilku różnych typów chemikaliów, takich jak Helixyte™ Green, Molecular Beacons i sondy TaqMan.

End-point RT-PCR

Analiza end-point RT-PCR, która opiera się na fazie plateau reakcji PCR, jest stosowana do analizy produktów amplifikacji po zakończeniu wszystkich cykli reakcji PCR. W tej metodzie, amplikony są rozdzielane przez elektroforezę na żelu agarozowym i wizualizowane przy użyciu barwnika wiążącego DNA, takiego jak bromek etydyny (EtBr), w celu określenia wielkości cząsteczek DNA w zakresie od 500 do 30,000 bp. Chociaż EtBr jest najczęściej stosowanym barwnikiem do wizualizacji DNA, jest on mutagenny i wysoce toksyczny przy wdychaniu. Zamiast tego należy rozważyć użycie bezpieczniejszych i bardziej przyjaznych dla środowiska, nietoksycznych alternatyw, takich jak Gelite™ X100 (nr kat. 17706), Helixyte™ Green (nr kat. 17590), Helixyte™ Gold (nr kat. 17595), Gelite™ Green (nr kat. 17589) lub Gelite™ Orange (nr kat. 17594).

Zalety, wady i zastosowania końcowego punktu RT-PCR

End-Point RT-PCR
Zalety	Wygodny – nadaje się do analizy każdej sekwencji dwuniciowego DNA Ekonomiczne – tańsze niż stosowanie sond projektowanych na zamówienie
Wady	Słaba precyzja i niska czułość Krótki zakres dynamiki < 2 logi Niska rozdzielczość, dyskryminacja wyłącznie na podstawie rozmiaru Nie nadaje się do automatyzacji Wyniki nie są wyrażone jako liczby Przetwarzanie post-PCR
Zastosowania	Analiza ekspresji genów Klonowanie Tworzenie bibliotek cDNA Sekwencjonowanie RNA Opracowanie sond do mikromacierzy Identyfikacja gatunków

Quantitative RT-PCR

W ilościowym RT-PCR (RT-qPCR), fluorescencyjne barwniki interkalujące DNA lub specyficzne dla sekwencji sondy fluorescencyjne są zintegrowane z reakcją RT-PCR, pozwalając na pomiar stężenia amplikonu w czasie rzeczywistym podczas fazy wykładniczej PCR. Łącząc amplifikację i detekcję w jednym etapie, RT-qPCR zapewnia większą precyzję i dokładność oraz produkuje dane ilościowe z zakresem dynamicznym o kilka rzędów wielkości większym niż RT-PCR z punktem końcowym. Ze względu na wyższą czułość, RT-qPCR jest rutynowo stosowany do analizy mRNA w ekspresji genów, badania obecności retrowirusów i walidacji wyników uzyskanych w analizach macierzowych.

Helixyte™ Green for RT-qPCR

RT-qPCR z użyciem fluorescencyjnych barwników interkalujących DNA, takich jak Helixyte™ Green (nr kat. 17591), stanowi najprostszą i najbardziej ekonomiczną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania amplikonów PCR w czasie rzeczywistym. Helixyte™ Green wiąże się z dwuniciowym DNA (dsDNA), a po wzbudzeniu emituje światło. Wraz ze wzrostem stężenia amplikonu w każdym kolejnym cyklu amplifikacji, wzrasta intensywność fluorescencji zielonego koloru Helixyte™ Green, w stopniu proporcjonalnym do ilości dsDNA obecnego w każdym cyklu PCR. Helixyte™ Green jest znacznie bezpieczniejszą alternatywą niż wysoce mutagenny EtBr i może być stosowany do monitorowania amplifikacji dowolnej sekwencji dsDNA z większą czułością i mniejszą inhibicją PCR. Ponieważ barwniki interkalujące DNA będą wiązać się z każdym dsDNA, takim jak primery i produkty niespecyficzne, ważne jest, aby używać dobrze zaprojektowanych primerów w celu uniknięcia amplifikacji sekwencji niebędących celem. W celu zapewnienia specyficzności amplifikacji oraz sprawdzenia artefaktów primera-dimeru, po amplifikacji należy przeprowadzić analizę krzywej topnienia.

TaqMan® Probes and Molecular Beacons for RT-qPCR

W RT-qPCR opartym na sondach, fluorescencyjnie znakowane, specyficzne dla danego celu sondy są używane do pomiaru amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym. Metoda ta korzysta z wyjątkowej specyficzności i daje użytkownikowi końcowemu możliwość multipleksowania wielu celów w pojedynczej reakcji. Spośród wielu dostępnych chemikaliów RT-qPCR opartych na sondach, najczęściej stosowane są sondy TaqMan® i Molecular Beacons, a obie zależą od transferu energii rezonansu Förstera (FRET) w celu wygenerowania sygnału fluorescencji. Sondy TaqMan® opierają się na aktywności 5′-nukleazy polimerazy Taq DNA. Krótkie sekwencje oligonukleotydów, komplementarne do interesującego nas celu, są znakowane fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym na 5′ końcu (patrz Tabela 4 poniżej) i niefluorescencyjnym barwnikiem wygaszającym na 3′ końcu (patrz Tabela 5 poniżej). Podczas cykli PCR, startery i sondy annektują do celu. Gdy polimeraza Taq DNA wiąże się i wydłuża primer przed sondą, zhybrydyzowana sonda jest hydrolizowana i uwalniany jest fragment zawierający barwnik reporterowy. Sygnał fluorescencji może być teraz wykryty, a ilość wygenerowanego sygnału fluorescencji jest proporcjonalna do ilości wytworzonych produktów qPCR.

Podobnie jak sondy TaqMan®, Molecular Beacons są znakowane fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym na 5′ końcu i niefluorescencyjnym barwnikiem wygaszającym na 3′ końcu. Jednakże metoda ta nie opiera się na aktywności 5′ nukleazy polimerazy Taq DNA w celu wygenerowania sygnału, a raczej Molecular Beacons są zaprojektowane tak, aby pozostały nienaruszone podczas całego procesu amplifikacji. W przypadku nieobecności celu, Beacony Molekularne pozostają potwierdzone w formie „szpilki do włosów” dzięki samokomplementarnej strukturze łodygi. To sprawia, że zarówno fluorescencyjny reporter jak i barwniki ksenonowe znajdują się blisko siebie zapobiegając fluorescencji sondy. Kiedy radiolatarnia molekularna hybrydyzuje do swojego celu, fluorescencyjny reporter i quencher zostają rozdzielone, a barwnik reporterowy emituje światło o charakterystycznej długości fali.

Fluorescencyjne barwniki reporterowe do znakowania 5′ lub 3′ końca sond qPCR o określonej sekwencji.

Barwniki typu Quencher do znakowania 5′ lub 3′ końca sond qPCR o określonej sekwencji.