Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy) jest podstawową techniką wykorzystywaną w badaniach z zakresu biologii molekularnej do szybkiej amplifikacji określonego wzorca DNA in vitro. Umożliwia ona naukowcom generowanie znacznych ilości próbki DNA do szerokiego zakresu zastosowań laboratoryjnych i klinicznych, w tym klonowania, genotypowania, sekwencjonowania, mutagenezy, kryminalistyki oraz wykrywania patogenów w diagnostyce chorób zakaźnych. Od czasu wprowadzenia w 1985 roku, opracowano kilka iteracji procesu PCR, w tym ilościowy PCR (qPCR) do monitorowania amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym oraz PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) do wykrywania RNA, narzędzia, które stało się kluczowe w diagnostyce wirusów.

W celu dokładnej i czułej detekcji PCR, AAT Bioquest oferuje kompleksowe portfolio barwników referencyjnych PCR, trifosforanów deoksynukleotydów, barwników wiążących dwuniciowe DNA oraz fluorescencyjnych barwników reporterowych i niefluorescencyjnych wygaszaczy do rozwoju sekwencyjnie specyficznych sygnalizatorów molekularnych.

Zasady PCR

PCR jest powszechnie stosowany do amplifikacji pojedynczego szablonu DNA do milionów lub miliardów identycznych kopii in vitro. Typowa reakcja amplifikacji wymaga szablonu DNA, termostabilnej polimerazy DNA, primerów forward i reverse, trifosforanów deoksynukleotydów (dNTPs) oraz buforu reakcyjnego (Tabela 1). Składniki są łączone w probówce PCR lub Eppendorf, a następnie umieszczane w termocyklerze w celu ułatwienia procesu amplifikacji. Wewnątrz termocyklera mieszanina PCR poddawana jest serii regulacji temperatury i czasu, co obejmuje trzy kluczowe etapy: (1) denaturację szablonu, (2) annealację primera oraz (3) wydłużenie primera.

Proces PCR

Podczas procesu denaturacji, dwuniciowy szablon DNA jest podgrzewany w temperaturze 95°C przez dwie minuty. Wysoka temperatura powoduje rozdzielenie wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi parami zasad w szablonie DNA na dwa jednoniciowe składniki. Następnie, temperatura jest obniżana do 50-65°C na około 20-40 sekund, aby ułatwić annealię primera do każdej pojedynczej nici DNA. Po annealingu temperatura jest podnoszona do 70-74°C w celu zainicjowania elongacji. W tym etapie polimerazy DNA wiążą się do primera i wydłużają go, tworząc powstającą nić DNA. Czyni to przesuwając się wzdłuż szablonu DNA baza po bazie w kierunku od 5′ do 3′ i dodając odpowiednie komplementarne dNTP z mieszaniny reakcyjnej. Łącznie te trzy etapy nazywane są cyklem PCR, a po każdym cyklu liczba dwuniciowych fragmentów DNA podwaja się. Cykle PCR są powtarzane 25 do 30 razy, aby w sposób wykładniczy amplifikować oryginalny szablon DNA.

 

Zestawienie składników potrzebnych do PCR.

 

Składnik PCR Funkcja
Szablon DNA Jest to próbka DNA zawierająca docelową sekwencję, która ma być amplifikowana.
Termostabilna polimeraza DNA Enzym, który katalizuje tworzenie nowych nici DNA komplementarnych do sekwencji docelowej. Powszechnie stosowane polimerazy obejmują Taq polimerazę DNA i Pfu polimerazę DNA.
Podkłady (przód i tył) Krótkie, jednoniciowe sekwencje DNA, które hybrydyzują do przykładowego DNA i rozpoczynają proces replikacji. Primery są zaprojektowane tak, aby uzupełniały sekwencje na początku i końcu szablonu DNA przeznaczonego do amplifikacji.
Trifosforany deoksynukleotydów (dNTPs) Są one „budulcem”, z którego syntetyzowane będą fragmenty DNA i są powszechnie dostępne w gotowych do użycia formach, takich jak ReadiUse™ dNTP Mix *10 mM* (nr kat. 17200).
Bufor reakcyjny zawierający magnez Zapewnia to stabilne środowisko dla reakcji PCR. Posiada odpowiednie pH od 8,0 do 9,5 i jest wzbogacony o chlorek magnezu, kofaktor polimerazy DNA.

AAT Bioquest

Inni dostawcy:

1