Elektroforeza żelowa

Elektroforeza żelowa jest podstawową techniką molekularną stosowaną rutynowo w badaniach z zakresu nauk biologicznych do rozdzielania i analizy naładowanych makrocząsteczek. Poprzez zastosowanie pola elektrycznego do medium opartego na żelu, makrocząsteczki takie jak białka i fragmenty kwasów nukleinowych mogą być rozdzielane i oczyszczane w zależności od ich wielkości, ładunku lub konformacji. Metody elektroforetyczne w żelu, choć powszechnie stosowane jako procedura analityczna po PCR, odniosły również sukces jako technika przygotowawcza przed blottingiem, klonowaniem, sekwencjonowaniem DNA i innymi zastosowaniami.

 

Rodzaje elektroforezy żelowej

Dwie najczęściej stosowane metody elektroforetyczne to elektroforeza w żelu agarozowym do rozdzielania kwasów nukleinowych i elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozdzielania białek i fragmentów kwasów nukleinowych o długości 500 par zasad lub mniejszej. Poniższa tabela podsumowuje kluczowe różnice pomiędzy elektroforezą w żelu agarozowym i poliakrylamidowym.

 

 

Metoda elektroforetyczna Elektroforeza w żelu agarozowym Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Typ żelu Agaroza Poliakrylamid
Skład żelu Agaroza jest polisacharydem pozyskiwanym z wodorostów. Żel zawiera długie łańcuchy połączonych ze sobą cukrów, tworzących siatkę. Poliakrylamid jest żywicą syntetyczną wytwarzaną przez trawienie akrylonitrylu hydratazą nitrylową. Żel powstaje w wyniku chemicznego usieciowania akrylamidu i bis-akrylamidu w celu wytworzenia sita molekularnego.
Metoda odlewania w żelu Żel zastyga w miarę stygnięcia. Proszek agarozy miesza się w buforze i podgrzewa w mikrofalówce. Następnie mieszaninę wlewa się do ramki na żel i pozostawia do zastygnięcia. Żel zastyga w wyniku reakcji chemicznej, gdy następuje usieciowanie.
Właściwości porów Stężenie dyktuje wielkość porów. Wielkość porów staje się mniejsza wraz ze wzrostem stężenia. (Typowe stężenie wynosi 0,5-2%). Stosunek akrylamidu do bis-akrylamidu dyktuje wielkość porów. (Typowe stężenie wynosi 6-15%)
Uruchom Konfigurację Żel jest prowadzony poziomo. Żel jest prowadzony pionowo.
Aplikacja Rozdziela fragmenty kwasów nukleinowych o długości 50-20,000 par zasad. Rozdziela białka i fragmenty kwasów nukleinowych o długości 5-500 par zasad (np. oligonukleotydy, miRNA, tRNA itp.).
Zalety
  • Nietoksyczne podłoże żelowe
  • Żele są łatwe do odlewania i szybko zastygają
  • Dobre do rozdzielania dużych cząsteczek DNA, takich jak produkty PCR i dwuniciowe DNA
  • Próbki mogą być odzyskane z żelu albo przez stopienie żelu, trawienie enzymami agarozy, lub traktowanie solami chaotropowymi
  • Stabilny, chemicznie usieciowany żel
  • Pory są jednolitej wielkości
  • Wysoka zdolność rozdzielcza, ostre pasma
  • Dobre do rozdzielania fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak jednoniciowe DNA
Wady
  • Agaroza jest kosztowna
  • Porównywalnie niska zdolność rozdzielcza, rozmyte pasma
  • Słabe oddzielanie fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej
  • Brak jednolitej wielkości porów
  • Toksyczne monomery (np. akrylamid jest silną neurotoksyną)
  • Żele są uciążliwe w przygotowaniu i podatne na wycieki
  • Każdy eksperyment wymaga nowego żelu

Zobacz naszą listę żeli

Barwniki kwasów nukleinowych do elektroforezy w żelu agarozowym i poliakrylamidowym

AAT Bioquest

Inni dostawcy:

1