Elektroforeza żelowa
Elektroforeza żelowa jest podstawową techniką molekularną stosowaną rutynowo w badaniach z zakresu nauk biologicznych do rozdzielania i analizy naładowanych makrocząsteczek. Poprzez zastosowanie pola elektrycznego do medium opartego na żelu, makrocząsteczki takie jak białka i fragmenty kwasów nukleinowych mogą być rozdzielane i oczyszczane w zależności od ich wielkości, ładunku lub konformacji. Metody elektroforetyczne w żelu, choć powszechnie stosowane jako procedura analityczna po PCR, odniosły również sukces jako technika przygotowawcza przed blottingiem, klonowaniem, sekwencjonowaniem DNA i innymi zastosowaniami.
Rodzaje elektroforezy żelowej
Dwie najczęściej stosowane metody elektroforetyczne to elektroforeza w żelu agarozowym do rozdzielania kwasów nukleinowych i elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozdzielania białek i fragmentów kwasów nukleinowych o długości 500 par zasad lub mniejszej. Poniższa tabela podsumowuje kluczowe różnice pomiędzy elektroforezą w żelu agarozowym i poliakrylamidowym.
Metoda elektroforetyczna | Elektroforeza w żelu agarozowym | Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym |
Typ żelu | Agaroza | Poliakrylamid |
Skład żelu | Agaroza jest polisacharydem pozyskiwanym z wodorostów. Żel zawiera długie łańcuchy połączonych ze sobą cukrów, tworzących siatkę. | Poliakrylamid jest żywicą syntetyczną wytwarzaną przez trawienie akrylonitrylu hydratazą nitrylową. Żel powstaje w wyniku chemicznego usieciowania akrylamidu i bis-akrylamidu w celu wytworzenia sita molekularnego. |
Metoda odlewania w żelu | Żel zastyga w miarę stygnięcia. Proszek agarozy miesza się w buforze i podgrzewa w mikrofalówce. Następnie mieszaninę wlewa się do ramki na żel i pozostawia do zastygnięcia. | Żel zastyga w wyniku reakcji chemicznej, gdy następuje usieciowanie. |
Właściwości porów | Stężenie dyktuje wielkość porów. Wielkość porów staje się mniejsza wraz ze wzrostem stężenia. (Typowe stężenie wynosi 0,5-2%). | Stosunek akrylamidu do bis-akrylamidu dyktuje wielkość porów. (Typowe stężenie wynosi 6-15%) |
Uruchom Konfigurację | Żel jest prowadzony poziomo. | Żel jest prowadzony pionowo. |
Aplikacja | Rozdziela fragmenty kwasów nukleinowych o długości 50-20,000 par zasad. | Rozdziela białka i fragmenty kwasów nukleinowych o długości 5-500 par zasad (np. oligonukleotydy, miRNA, tRNA itp.). |
Zalety |
|
|
Wady |
|
|