DNA i RNA

Dokładne oznaczenie ilościowe kwasów nukleinowych jest istotnym etapem przygotowania próbek DNA i RNA i regularnie przyczynia się do sukcesu (lub porażki) różnych eksperymentów molekularnych. Metody powszechnie stosowane do ilościowego oznaczania DNA i RNA obejmują pomiary absorbancji (UV-Vis), pomiary fluorescencji oraz łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR). Chociaż każda z tych metod ma swoje zalety, wybór właściwej technologii może zaoszczędzić sporo czasu i pieniędzy, a zależy głównie od potrzeb eksperymentalnych i planowanego dalszego zastosowania.

Dla wydajnej i efektywnej kwantyfikacji kwasów nukleinowych, AAT Bioquest oferuje różne produkty, w tym ręczne fluorometry, zestawy Helixyte™ i Portelite™ do fluorescencyjnego oznaczania stężenia DNA lub RNA oraz barwniki i sondy wiążące DNA do kwantyfikacji opartej na qPCR.

 

Kwantyfikacja kwasów nukleinowych metodą absorbancji i fluorescencji

 

Tradycyjnie, stężenia DNA i RNA są określane ilościowo poprzez pomiar absorpcji światła za pomocą spektrofotometrii UV-VIS. Absorbancja jest mierzona przy 260 nm, gdzie zarówno DNA jak i RNA najsilniej absorbują światło, a całkowite stężenie kwasu nukleinowego jest określane przy użyciu określonego współczynnika konwersji. Dodatkowo, pomiary wykonywane przy 230, 280, 320 lub 340 nm mogą być stosowane do wykrywania zanieczyszczeń niebędących kwasami nukleinowymi, takich jak białka, materiały organiczne i inne związki zakłócające. Chociaż metody absorpcyjne są korzystne ze względu na ich prostotę, zdolność do wykrywania zanieczyszczeń i dostarczają informacji na temat czystości próbki, nie mogą one jednak rozróżniać DNA i RNA, ponieważ oba absorbują światło przy 260 nm.

Metody ilościowe oparte na fluorescencji, wykorzystujące barwniki fluorescencyjne, które selektywnie wiążą się z dwuniciowym DNA, jednoniciowym DNA lub RNA, takie jak Helixyte™ Green dsDNA, Helixyte™ Green ssDNA lub StrandBrite™ Green RNA, pozwalają na bardziej czułe i specyficzne oznaczanie kwasów nukleinowych w porównaniu z konwencjonalną metodą spektroskopii UV-Vis. Sygnał fluorescencyjny, który jest mierzony przez fluorometry, jest proporcjonalny do ilości kwasu nukleinowego obecnego w próbce, a ponieważ barwniki fluorescencyjne wiążą się w wysoce specyficzny sposób, pomiary są dokładne pomimo możliwego zanieczyszczenia. Kluczową różnicą pomiędzy tymi dwiema metodami jest to, że kwantyfikacja poprzez fluorescencję jest metodą pośrednią i dlatego wymaga wygenerowania krzywej kalibracyjnej z próbek standardowych o znanym stężeniu przed kwantyfikacją.

 

Porównanie metod kwantyfikacji kwasów nukleinowych opartych na absorbancji i fluorescencji

Spektrofotometria UV-VIS

Zalety:
– Szybki i łatwy w użyciu
– Nie jest niebezpieczny – nie wymaga żadnych odczynników
– Dostarcza informacji o czystości próbki

Wady:
– Ograniczona czułość przy niskim poziomie hałasu
– Niedokładności wprowadzane przez zanieczyszczenia
– Brak możliwości rozróżnienia pomiędzy ssDNA, dsDNA lub RNA

Fluorescence

Zalety:
– Szybki i łatwy w użyciu
– Wysoka czułość i dokładność
– Idealny do analizy próbek o niskim poziomie zanieczyszczeń
– Zanieczyszczenia mają minimalny wpływ na wyniki
– Preferencyjne wykrywanie gatunków kwasów nukleinowych

Wady:
– Wymaga kalibracji za pomocą próbek wzorcowych

Zestawy do oznaczania ilościowego DNA Helixyte™ Green i samodzielne odczynniki

Seria zestawów testowych Helixyte™ Green i samodzielnych odczynników jest przeznaczona do prostego, dokładnego i czułego oznaczania stężenia ssDNA, dsDNA lub całkowitego stężenia kwasów nukleinowych w roztworze przy użyciu standardowego fluorescencyjnego czytnika mikropłytek. Każdy zestaw testów Helixyte™ jest specjalnie opracowany z zastosowaniem selektywnego barwnika DNA, gotowego do użycia buforu, wstępnie rozcieńczonych standardów DNA oraz zoptymalizowanego protokołu, co pozwala na dokładne oznaczanie ilościowe w szerokim zakresie stężeń przy minimalnych zakłóceniach powodowanych przez typowe zanieczyszczenia.

W przeciwieństwie do pomiarów absorpcyjnych, testy te są o kilka rzędów wielkości bardziej czułe w szerokim liniowym zakresie detekcji i idealnie nadają się do ilościowego oznaczania o wysokiej wydajności przy użyciu płytek 96- lub 384-dołkowych. Zestaw Helixyte™ Green Fluorimetric dsDNA Quantitation Kit *High Sensitivity* może być używany do wykrywania już od 25 pg/mL dsDNA w złożonych roztworach, co czyni go idealnym do ilościowego oznaczania genomowego DNA, wirusowego DNA, miniprepów DNA, produktów amplifikacji PCR i innych zastosowań wymagających małych objętości DNA.

 

 

Zestawy do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych Portelite™ do stosowania z fluorometrami CytoCite™ BG100 i Qubit®

Zestawy do fluorymetrycznego oznaczania ilościowego Portelite™, zoptymalizowane dla fluorometru CytoCite™ BG100, zostały zaprojektowane do selektywnego oznaczania ilościowego całkowitego kwasu nukleinowego, DNA (ssDNA, dsDNA) i RNA, zapewniając bardziej czułą analizę niż porównywalne instrumenty oparte na absorpcji UV. Wyżej wymienione zestawy są odpowiednie do różnych powszechnych zastosowań biologicznych, w tym klonowania, sekwencjonowania, transfekcji, qPCR i elektroforezy żelowej. Wszystkie testy są przeprowadzane przy użyciu tego samego ogólnego protokołu, zapewniając prosty format testu typu „wymieszaj i odczytaj” przy minimalnym czasie pracy.

Każdy zestaw Portelite™ zawiera skoncentrowany odczynnik testowy, bufor do rozcieńczania i wstępnie rozcieńczone standardy. Sondy fluorescencyjne w każdym zestawie mają podobne właściwości spektralne, są wzbudzane światłem niebieskim (480 nm), z emisją pomiędzy 510 nm a 580 nm. Chociaż zestawy fluorometryczne Portelite™ zostały opracowane specjalnie do użytku z fluorometrem CytoCite™ BG100, mogą być również używane w innych dostępnych na rynku kompaktowych urządzeniach fluorometrycznych, takich jak fluorometr Qubit®. Oprócz zestawów do oznaczania ilościowego Poretelite™ opisanych powyżej, oferujemy zestawy Portelite™ do oznaczania ilościowego endotoksyn i białek.